ELISA實(shí)驗(yàn)——原理、步驟

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

1. 檢測(cè)生物樣品中抗體、抗原、蛋白質(zhì)和糖蛋白等物質(zhì)的含量。

2. 藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)、篩選。

二、ELISA實(shí)驗(yàn)原理

免疫吸附測(cè)定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，

由Eva Engvall和 Peter Perlmann 于1971年描述。

這一方法的基本原理是：

①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。

②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本

（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的

抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，

底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析

。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度

三、ELISA實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣品準(zhǔn)備

a. 細(xì)胞上清樣品，需將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞消化離心取上清即可（如800g，5分鐘）。

b. 血清樣品，將全血收集至不含抗凝劑的試管內(nèi)，在室溫下放置1小時(shí)，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1500g離心10分鐘

，取黃色上清即得血清。

c. 血漿樣品，將全血收集至含抗凝劑的試管內(nèi)，混勻后置冰上，4℃約1500g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿。

2. 確定樣品測(cè)試組、標(biāo)準(zhǔn)品和空白組組所需的微孔條數(shù)量，每個(gè)濃度做兩個(gè)平行重復(fù)，從支架上取出對(duì)應(yīng)數(shù)量的微孔條，剩余儲(chǔ)存在

箔袋中，密封后在4℃儲(chǔ)存。

3. 配制對(duì)應(yīng)濃度的捕獲抗體溶液、檢測(cè)抗體溶液、包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液、鏈霉親和素-HRP

（若使用試劑盒則沒有此步驟或按試劑盒要求配制）。

4. 每孔加入100μL 捕獲抗體溶液，用封板膜覆蓋，4℃孵育過夜，過夜后舍棄舍板內(nèi)溶液。

5. 每孔加入300-400μL洗滌液清洗五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干（若使用試劑盒則沒有步驟4和5）。

6. 用樣品稀釋液按照1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:2000稀釋樣品，以此確定樣品IL-2的最佳檢測(cè)濃度。

7. 配制梯度濃度的IL-2蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，將工作濃度設(shè)置為1200pg/mL, 600pg/mL, 300pg/mL, 150pg/mL, 75pg/mL, 37.5pg/mL,

18.75pg/mL，9.38pg/mL，以此濃度來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8. 分別將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液按照100μL/孔加入相應(yīng)孔中作為標(biāo)測(cè)試組、標(biāo)準(zhǔn)品組、空白組。

9. 將偶聯(lián)生物素的抗人IL-2抗體按照50μL/孔加入所有孔中，用封板膜覆蓋，室溫避光孵育2小時(shí)。

10. 每孔加入300-400μL洗滌液洗板五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。

11. 在所有孔加入100μL稀釋后的鏈霉親和素-HRP，用封板膜覆蓋，室溫避光孵育1小時(shí)。

12. 每孔加入300-400μL洗滌液洗板五次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。

13. 在所有孔中加入100μL TMB顯色液。用封板膜覆蓋，室溫避光孵育30min。

14. 在所有孔中加入終止液50μL，混勻后立即測(cè)量A450值。

15. 計(jì)算每一組重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度值。重復(fù)次數(shù)應(yīng)在平均值的20%以內(nèi)。

16. 繪制IL-2標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。

通過樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的相應(yīng)濃度。

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