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| WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果有黑點(diǎn) | |
| 原因 | 解決方案 |
| 封閉液未溶解 | a. 確認(rèn)奶粉溶解。出現(xiàn)黑點(diǎn)最常發(fā)生的原因是奶粉沒有溶解，建議加入攪拌子，增加攪拌時間，或是溶解后離心取上清液使用。 b. 利用0.45 um的濾紙過濾溶液，以除去未溶解的牛奶顆粒及其他雜質(zhì)。 c. 改變封閉液的種類，如換為BSA。 |
| 溶液污染 | a. 使用新鮮配制的溶液 （跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗脫等緩沖液）或商業(yè)化溶液，以減少因長菌長霉造成的黑點(diǎn)。 b. 確認(rèn)一抗溶液是否保存不當(dāng)，可嘗試重新配置一抗溶液。 |
| 封閉液及抗體交互作用 | 一般脫脂牛奶中含有casein這種磷酸蛋白，可能會與磷酸化抗體產(chǎn)生非特異性結(jié)合，因此，如使用磷酸化抗體，建議用BSA作為封閉溶液，同時洗脫溶液也用TBST，如此可降低黑點(diǎn)或高背景值狀況。 注：a. TBST是以Tris為基底，PBST是以磷酸鹽為基底的緩沖液，一般根據(jù)習(xí)慣選擇使用TBST或PBST。但如果是操作磷酸化抗體或最終顯色分析是用AP系統(tǒng)時，因?yàn)镻BST中的磷酸根會干擾，可能會造成高背景值或無信號，此時建議使用TBST緩沖液。另外，同一次實(shí)驗(yàn)中請使用一種緩沖液，不可封閉液用PBST，洗脫液用TBST。 b. 封閉時一般使用3-5%封閉溶液，依實(shí)驗(yàn)特性不同，可做微調(diào)；牛奶與BSA的選擇也是相同，掌握原則后，再依實(shí)驗(yàn)特性做微調(diào)，就能快速上手。 |
| WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果信號過曝 | |
| 原因 | 解決方案 |
| 蛋白樣品過量 | 降低蛋白上樣量。通常蛋白上樣量為30-50 ug，但有些蛋白的表達(dá)量較高（如beta actin），此時可依蛋白表現(xiàn)量，調(diào)整上樣量。 |
| 抗體過量 | a. 提高抗體稀釋倍數(shù)。產(chǎn)生過曝時可提高一抗、二抗的稀釋倍數(shù)。 b. 減少孵育時間 c. 于4℃孵育 |
| 信號過曝 | a. 縮短曝光時間。過曝時可縮短曝光時間，減少過曝的情形。 b. 使用低靈敏度的化學(xué)發(fā)光底物。過曝現(xiàn)象也有可能是因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光底物過強(qiáng)導(dǎo)致的, 可選用靈敏度較低的化學(xué)發(fā)光底物來改善。 注：化學(xué)發(fā)光底物一般有三種等級，femto（飛克, 10-15g）， pico（皮克, 10-12g）, 及plus（低皮克級, 10-12~ 10-9g），可依蛋白表達(dá)量挑選適合的化學(xué)發(fā)光底物。 |
| WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果拖帶 | |
| 原因 | 解決方案 |
| 樣本不純，有雜質(zhì)污染 | a. 重新離心樣品后取上清液使用 b. 使用較純的試劑配置細(xì)胞裂解液或購買商業(yè)化產(chǎn)品 c. 使用Benzonase®核酸酶。Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白樣品粘度，減少核酸對跑膠的干擾 d. 全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取。使用商業(yè)化全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取試劑盒提取蛋白樣品，減少配制試劑溶液以及操作中分離不干凈的問題。 |
| 蛋白樣品過量 | a. 降低蛋白上樣量。通常蛋白上樣量為30-50ug，但有些蛋白表達(dá)量較高(如beta actin)，此時可依蛋白表達(dá)量，進(jìn)行微調(diào)。 b. 延長加熱時間。蛋白變性不, 也會使條帶成團(tuán)拖尾，此時可通過延長樣品加熱時間（一般約5分鐘）及調(diào)整SDS（一般是2 %）比例, 使蛋白變性更。 |
| 信號過曝 | a. 縮短曝光時間。過曝時可縮短曝光時間, 減少過曝的情形。 |
| b. 使用低靈敏的化學(xué)發(fā)光底物。過曝現(xiàn)象可能是因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光底物過強(qiáng)導(dǎo)致的, 可選用靈敏度較低的化學(xué)發(fā)光底物來改善。 | |
| WB條帶扭曲 | |
| 原因 | 解決方案 |
| 膠沒配置好 | a. 確保APS & TEMED 正常, 并新鮮配置膠體。 APS為起始劑，主要負(fù)責(zé)提供自由基供膠體進(jìn)行聚合反應(yīng)， APS粉末容易受潮，建議置于防潮箱保存，如果發(fā)生結(jié)塊，建議重新購買。TEMED為催化劑，如果保存不當(dāng)或過期，也會影響膠體聚合，建議分裝。 b. 小心移除齒梳，避免造成加樣壁孔歪斜 c. 配完下層膠后，需用水或醇類將膠體壓平 d. 膠里面有雜質(zhì)/氣泡?？深A(yù)先用0.45 um濾紙過濾膠體溶液，混合膠體溶液時，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。 |
| 電流電壓問題 | a. 避免用高電壓電泳使膠體過熱。 150V，過熱有霧氣，80-100V，上膠帶短、下層不勻。 b. 空的孔道加樣品緩沖液，使每個孔洞都有樣品且鹽類成分相近。 c. 避免孔洞中有雜質(zhì)，用高純度等級的化學(xué)藥品或用商業(yè)化試劑提取蛋白樣品，或在上樣前用跑膠緩沖溶液沖洗加樣孔。 |
| 轉(zhuǎn)膜問題 | a. 膠體應(yīng)與膜密合，轉(zhuǎn)膜時小心滾壓膠體，使膠體與膜貼合緊實(shí) b. 轉(zhuǎn)膜時小心勿晃動。有時出現(xiàn) 2個條帶是因?yàn)檗D(zhuǎn)膜時發(fā)生晃動，產(chǎn)生疊影 條帶呈啞鈴狀 出現(xiàn)啞鈴最大的可能是膠沒有配置好，膠凝固后不均一，拔完梳子之后，某些孔道凸起不平整，可以試著注意膠體是否凝固（確認(rèn)試劑沒問題），拔梳子時注意不要讓孔道歪掉，loading前也可以再用running buffer沖洗孔道，另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質(zhì)，沒有離心下來，或沒有溶解，然后雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白因此被推擠到兩邊。 |
| 條帶呈啞鈴狀 | 原因：出現(xiàn)啞鈴狀最可能是膠沒有配制好，膠凝固后不均，拔完齒梳之后，某些孔道凸起不平整，另一種可能是樣品中含有過多雜質(zhì)，沒有離心下來，或沒有溶解，導(dǎo)致雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白因此被推擠到兩邊。 解決方案：確認(rèn)膠體是否凝固，拔齒梳時注意不要讓孔道歪斜，上樣前可再用跑膠緩沖液沖洗孔道。 |
| WB背景值較高 | |
| 原因 | 解決方案 |
| 封閉不足 | a. 提高封閉液濃度，確保封閉液覆蓋轉(zhuǎn)印膜，如使用5% 脫脂奶粉或BSA。 b. 增加封閉時間，一般情況會使用37℃封閉1小時，可視情況調(diào)整封閉的條件。 c. 使用BSA作為封閉液，同時搭配使用TBST的洗脫液來降低高背景值的狀況。 |
| 抗體問題 | a. 抗體濃度太高。建議降低抗體濃度，并增加洗滌次數(shù)和時間。 b. 一抗孵育溫度過高，建議4℃孵育過夜。 c. 二抗的非特異性背景，可增加二抗對照，以陽性對照組確認(rèn)二抗。 d. 洗脫不足，增加洗脫液體積和洗滌次數(shù)。 |
| 顯色問題 | 化學(xué)發(fā)光底物過多，建議調(diào)整化學(xué)發(fā)光底物，按說明書加入適量的顯色底物。也可依據(jù)蛋白表達(dá)量的不同，選擇合適的化學(xué)放光底物。 |
| 膜的問題 | a. 挑選合適的NC或PVDF膜。依據(jù)靶標(biāo)蛋白、想要呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及膜的特性，選擇出適合實(shí)驗(yàn)的材料。 b. 建議實(shí)驗(yàn)過程中都必須注意讓膜保持濕潤，特別是PVDF膜。 c. 在使用PVDF膜時可能會出現(xiàn)浸潤不均勻的情況，從而導(dǎo)致背景值比較高的情況。因此，建議使用PVDF膜前使用100% methanol浸潤膜。 |
| WB條帶非專一性 | |
| 原因 | 解決方案 |
| 蛋白質(zhì)降解 | a. 蛋白質(zhì)抑制劑或磷酸酶抑制劑 b. 冰上操作 c. 避免反復(fù)凍融 |
| 蛋白質(zhì)形成多聚糖 | a. 使用現(xiàn)配的DTT/2-ME，并將加熱時間延長 b. 確認(rèn)樣本煮沸時的溫度達(dá)到95-100℃ |
| 確認(rèn)蛋白質(zhì)特性 | 查詢生物信息確認(rèn)蛋白是否存在后修飾、剪切體等。 |
| 抗體濃度過高或蛋白樣品過量 | a. 調(diào)整蛋白上樣量為30-50 ug或減少上樣量 b. 增加抗體稀釋倍數(shù) |
| 抗體非專一性結(jié)合 | a. 增加洗膜次數(shù)與除垢劑強(qiáng)度 b. 設(shè)對照組確認(rèn)抗體專一性 c. 詢問抗體公司技術(shù)支持 |
| 抗體認(rèn)到輕重鏈的信號 | a. 換不同宿主來源的一抗 b. 使用EasyBlot二抗 |
| 目標(biāo)信號微弱 | |
| 原因 | 解決方案 |
| 蛋白問題 | a. 了解靶標(biāo)蛋白的特性 ? 是否存在特異性? 可提取特定細(xì)胞器增加蛋白濃度，例：抽取核蛋白、膜蛋白、胞質(zhì)蛋白。 ? 是否存在組織特異性? 有些目標(biāo)蛋白只會在特定組織表達(dá)，這可降低樣本挑選的錯誤率。 ? 是否有后修飾作用? 目標(biāo)蛋白后修飾分子量會變大，使抗體認(rèn)到的位置比估算分子量高。 ? 確認(rèn)靶標(biāo)蛋白在細(xì)胞株的表達(dá)量以及是否需加藥誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。 b. 增加蛋白質(zhì)上樣量。一般蛋白上樣量為20-30μg/孔, 如文獻(xiàn)已表明靶標(biāo)蛋白表達(dá)量低或是使用極少的上樣量（例如< 10μg），需增加上樣量來協(xié)助抗體偵測其信號。 c. 減少蛋白降解。 ? 細(xì)胞萃取時要加蛋白質(zhì)抑制劑或磷酸酶抑制劑，避免蛋白降解。 ? 在冰上操作蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)。 ? 避免反復(fù)凍融樣品(建議分裝)。 ? 新鮮制備新一批的樣本。 |
| 抗體問題 | a. 調(diào)整抗體孵育條件。 ? 增加抗體量，例如原本使用1:1000稀釋，調(diào)整為1:500稀釋。 ? 增加孵育時間：將原37℃孵育1小時改成4℃孵育過夜。 b. 一抗二抗不相容。檢查二抗與一抗種屬是否有正確配對，要訣：“鼠配鼠兔配兔，isotype相配不出錯"。 c. 過度洗脫。減少洗脫次數(shù)與時間：一般洗脫三次, 每次5-10分鐘即可。 |
| 轉(zhuǎn)膜問題 | a. 檢查轉(zhuǎn)膜方向。轉(zhuǎn)膜方向錯誤會讓蛋白往反方向移動散逸在轉(zhuǎn)膜緩沖液里，方向正確才能讓蛋白粘附咋轉(zhuǎn)印模的孔洞里。 b. 根據(jù)分子量調(diào)整轉(zhuǎn)膜條件。大分子蛋白轉(zhuǎn)膜條件可調(diào)整為低溫過夜（濕式轉(zhuǎn)膜），小分子蛋白改用0.2 um的轉(zhuǎn)印膜，縮短轉(zhuǎn)膜時間。 |
| 封閉過度 | a. 降低封閉液濃度：一般使用3-5%的牛奶或BSA做封閉液即可。 b. 降低封閉時間：一般封閉時間為30-60分鐘。 c. 換封閉液，可使用商業(yè)化封閉液（GTX30963）可協(xié)助避免這個問題的發(fā)生。 |
| 化學(xué)發(fā)光底物失活或敏感度不夠 | a. 使用現(xiàn)配的化學(xué)發(fā)光底物 b. 使用高敏感度的化學(xué)發(fā)光底物，例如使用飛克（GTX14698）等級的化學(xué)發(fā)光底物。 c. 增加曝光時間 |
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