RAPA3G Probe qPCR MasterMix試劑將熱啟動(dòng) RAPA3G

DNA 聚合酶、反應(yīng) Buffer、dNTP 染料等試劑預(yù)混在一起，

是一種 2×濃度的單組分預(yù)混試劑。該制品不含有 ROX 校正

染料，適用于各種熒光標(biāo)記探針，并且適用于各種定量 PCR

機(jī)型。優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，使得該制品可用于單重及多重的

探針?lè)ǘ?PCR。

制品中的 RAPA3G DNA 聚合酶為第三代 DNA 聚合酶，

其具有最高的雜質(zhì)耐受性，其對(duì)乙醇、胍鹽、肝素、血清、

植物多糖多酚具有的耐受性，因此可用于粗樣品的直接

定量 PCR 檢測(cè)(Direct PCR)。該酶經(jīng)化學(xué)法修飾，在 50℃

以下 100%無(wú)活性，只有 95 度條件下加熱 5min 后才能

恢復(fù)酶的活力。因此該系統(tǒng)可以有效抑制非特異性 PCR 擴(kuò)

增，極大的提高了 PCR 擴(kuò)增特異性。

 由于 RAPA3G DNA 聚合酶對(duì) dUTP 具有的識(shí)別能

力，該制品中的 dTTP 核酸堿基被 dUTP 所取代，因此

擴(kuò)增產(chǎn)物均包含 dUTP，在配合熱敏 UDG（該酶在 95℃熱

變性 5min 后不可逆失活，不影響后續(xù) PCR 反應(yīng)）的條件下

能達(dá)到最佳的防污染能力。在 10e5 copies 污染物的測(cè)試條

件下，Ct 推遲 15 個(gè)以上（污染去除能力>99.997%）。

包裝

2×RAPA3G Probe MasterMix (with UDG)

A2262A 1 ml

A2262B 25 ml

儲(chǔ)存：-20℃可保存 2 年。短期使用可放置 2-8℃，保存 3 個(gè)

月。如出現(xiàn)白色沉淀溶解后使用，不影響反應(yīng)性能。該試劑

經(jīng) 30 次凍融后性能無(wú)下降，因此不使用時(shí)請(qǐng)置于-20℃避光

保存。

RAPA3G DNA 聚合酶對(duì)抑制物耐受性

SDS 0.01% Serum 2%

EtOH 5% Plasma Citrate 2%

Heparin 0.1IU/ml Gua SCN 0.25%

Hematin 30μM Trizol 0.5%操作方法

1、按照如下組分配制 20 μl PCR 反應(yīng)體系：

 終濃度

2×RAPA3G Probe MasterMix(with UDG) 10 μl 1×

Primer F1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM

Primer R1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM

Probe1 (20 μM) 0.1-0.4 μl 0.1-0.4 μM

其它引物和探針 X

DNA 模板 0.5~2 μl

ddH2O Up to 20 μl

2. 進(jìn)行 Real-Time PCR 反應(yīng),通常采用兩步法，程序如下：

Stage 1 25℃ 2 min 去污染

Stage 2 95℃ 5 min 熱啟動(dòng)

Stage 3

40 循環(huán)

95℃ 5 s 變性

60℃ 30 s 收集信號(hào) 退火/延伸

注意：退火延伸溫度可在 55-65℃調(diào)整

3. 在多數(shù)情況下，采用兩步法程序可獲得理想的擴(kuò)增效果，

在無(wú)法達(dá)到預(yù)期理想效果的情況下，也可采用三步法 PCR

程序，程序如下：

Stage 1 25℃ 2 min 去污染

Stage 2 95℃ 5 min 熱啟動(dòng)

Stage 3

40 循環(huán)

95℃ 5 s 變性

55℃ 10 s 退火

72℃ 30 s 收集信號(hào) 延伸

4. 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn) Real-Time PCR 的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲

線。R Gre

注意：消化污染步驟中的溫度設(shè)置可在 25-37℃之間均可，無(wú)顯著

差異，但高于 42℃以上的溫度會(huì)導(dǎo)致熱敏 UDG 消化能力急劇下降。

恒溫?cái)U(kuò)增使用策略及實(shí)例展示

應(yīng)用實(shí)例1：A3825-01 紅黃變色反應(yīng)（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起始前，下圖為 65 度反應(yīng) 30min 后。

應(yīng)用實(shí)例2：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈨x上進(jìn)行反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測(cè)結(jié)果，可以看到檢測(cè)反應(yīng)<20min(達(dá)平臺(tái)期)。

應(yīng)用實(shí)例3： 用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試。OG變色法為終點(diǎn)變色策略，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，溶解管蓋上染料后，陽(yáng)性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類(lèi)型限制，雜質(zhì)耐受性很好。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測(cè)結(jié)果。

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