活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要包括羥基自由基、超氧自由基和過氧化氫。在細(xì)胞或組織的正常生理代謝過程中會(huì)

產(chǎn)生活性氧，同時(shí)一些環(huán)境因子例如紫外照射、環(huán)境污染等也可以誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，活性氧產(chǎn)生后可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂、

蛋白和DNA等的氧化損傷，誘發(fā)氧化應(yīng)激(Oxidative stress)，繼而導(dǎo)致各種腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、

肝損傷、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。機(jī)體中存在多種抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的

各種活性氧，以阻止活性氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激(oxidative stress)的產(chǎn)生；一個(gè)體系內(nèi)的各種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總

的水平即體現(xiàn)了該體系內(nèi)的總抗氧化能力，因此測(cè)定血漿、血清、尿液、唾液等各種體液，細(xì)胞或組織等裂解液中的總抗氧化

能力具有非常重要的生物學(xué)意義。

總抗氧化能力(FRAP微板法)即Total Antioxidant Capacity Assay Kit with ABTS method，

簡(jiǎn)稱T-AOC Assay Kit，是一種采用ABTS作為顯色劑，可以對(duì)血漿、血清、唾液、尿液等各種體液，細(xì)胞或組織等裂解液、

植物或中草藥抽提液、或各種抗氧化物(antioxidant)溶液的總抗氧化能力進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒；ABTS法測(cè)定T-AOC的檢測(cè)原理是

在氧化劑作用下ABTS被氧化成綠色的ABTS?+，在抗氧化物存在時(shí)ABTS?+的產(chǎn)生被抑制，可在734nm或405nm測(cè)定ABTS?+的

吸光度即可測(cè)定并計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。Trolox是一種維生素E的類似物，具有和維生素E相似的抗氧化能力，

可作為其它抗氧化物總抗氧化能力的參考，例如Trolox的總抗氧化能力為1，相同濃度情況下，其它物質(zhì)的抗氧化能力可用其抗氧

化能力和Trolox相比的倍數(shù)來表示，該試劑盒快捷方便，加入待測(cè)樣品3~6分鐘即可進(jìn)行吸光度測(cè)定，

通常10~20個(gè)樣品可以在20分鐘內(nèi)檢測(cè)完畢。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟(僅供參考)：

自備材料：

1、蒸餾水

2、電子天平、研缽或勻漿器、離心管或試管

3、低溫離心機(jī)、恒溫箱或水浴鍋、酶標(biāo)儀、酶標(biāo)板

操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品∶

①植物樣品︰取1g植物組織或水果中層果肉，加入2.5ml PAL Lysis Buffer，冰浴情況下充分搗碎研磨或勻漿，4℃ 10000r/min

離心15~20min，留取上清液，-20℃凍存，用于苯丙氨解氨酶的檢測(cè)。

②血漿、血清和尿液樣品︰血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測(cè)定，-20℃凍存，用于苯丙解氨的檢測(cè)。

③細(xì)胞或組織樣品∶取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液，如果有必要需進(jìn)行適當(dāng)勻漿，4℃ 10000r/min離心15~20min，取上清液，

-20℃凍存，用于苯丙酸解氨酶的檢測(cè)。④高活性樣品︰如果樣品中含有較高活性的苯丙解氨酶，可以使用蒸餾水或PAL

Lysis Buffer稀釋進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>

2、PAL加樣∶

取96孔板，按照下表設(shè)置對(duì)照孔、測(cè)定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并

注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的PAL活性過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置2平行孔，

求平均值。

加入物（μl）對(duì)照孔測(cè)定孔

蒸餾水150100

待測(cè)樣本5050

PAL Assay Buffer-50

3、PAL檢測(cè)︰

以對(duì)照孔為對(duì)照(調(diào)零)，酶標(biāo)儀立即測(cè)定290nm處測(cè)定孔的吸光度(記為   A測(cè)定0);40℃準(zhǔn)確孵育1h，立即加入10μl PAL終止

液終止反應(yīng)(備選方案)，以對(duì)照孔為對(duì)照調(diào)零，酶標(biāo)儀立即測(cè)定290nm處測(cè)定孔的吸光度(記為A測(cè)定1)。

注意︰加入PAL終止液終止反應(yīng)為非必須步驟，可37℃準(zhǔn)確孵育1h后直接以對(duì)照孔為對(duì)照調(diào)零，酶標(biāo)儀立即測(cè)定290nm處測(cè)定

孔的吸光度。

注意事項(xiàng)∶

1、待測(cè)樣品中不能含有酶抑制劑，同時(shí)需避免反復(fù)凍融。

2、獲得上清液為PAL酶液，應(yīng)盡快檢測(cè)，亦可-20°℃保存。

3、如果沒有可測(cè)定紫外區(qū)的酶標(biāo)儀和酶標(biāo)板，也可以使用紫外分光光度計(jì)和石英比色皿，但應(yīng)注意比色杯的最小檢測(cè)體積。

4、每次檢測(cè)指標(biāo)不宜過多，否則操作時(shí)間不一，有可能導(dǎo)致樣本間的差異。5、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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