本產(chǎn)品僅供科研，不得做其它用途

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本產(chǎn)品就是根據(jù)PCR原理專門開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

3. 產(chǎn)品精心優(yōu)化且特異性高，引物是根據(jù)高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟除此之外的其它微生物DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

4. PCR mix中含上樣染料，PCR后可以直接上樣電泳。

5. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的PCR反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于定性實(shí)驗(yàn)，不能用于定量。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研

GBP5探針法熒光定量PCR試劑盒使用手冊(cè)V1.0樣品的制備　

【試劑盒組成】

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。

定義和原理

PCR 探針法試劑盒是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，結(jié)合探針來檢測(cè)特定核酸序列的工具包。其原理是在常規(guī) PCR 基礎(chǔ)上，加入了一段能與目標(biāo)核酸序列特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記探針。在 PCR 擴(kuò)增過程中，當(dāng)探針與目標(biāo)序列結(jié)合后，通過熒光信號(hào)的變化來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR 產(chǎn)物的擴(kuò)增情況。

主要組成成分

探針：帶有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，在完整狀態(tài)下，淬滅基團(tuán)抑制熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)。當(dāng)探針與目標(biāo)序列結(jié)合并被核酸酶切割后，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。

DNA 聚合酶：負(fù)責(zé)在引物的引導(dǎo)下，將脫氧核苷酸（dNTPs）逐個(gè)添加到引物的 3' 端，合成新的 DNA 鏈。

dNTPs：即脫氧核苷三磷酸，包括 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP，是合成 DNA 的原料。

反應(yīng)緩沖液：為 PCR 反應(yīng)提供適宜的 pH 值、離子強(qiáng)度等環(huán)境條件，保證 DNA 聚合酶的活性和反應(yīng)的順利進(jìn)行。

常見類型

TaqMan 探針法試劑盒：TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，其 5' 端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3' 端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。在 PCR 擴(kuò)增過程中，Taq DNA 聚合酶的 5'-3' 外切酶活性會(huì)將與目標(biāo)序列結(jié)合的探針切割，使熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)增強(qiáng)。通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR 產(chǎn)物的擴(kuò)增情況。

分子信標(biāo)探針法試劑盒：分子信標(biāo)是一種具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，其兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。在沒有目標(biāo)序列存在時(shí)，分子信標(biāo)呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)靠近，熒光信號(hào)被淬滅。當(dāng)存在目標(biāo)序列時(shí)，分子信標(biāo)與目標(biāo)序列雜交，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光信號(hào)。

2. 樣品制備

DNA提?。菏褂眠m合的DNA提取試劑he提取待測(cè)樣品中的DNA，確保DNA的純度和完整性。

樣品處理：樣品需在0-4℃條件下處理，避免RNA降解，并在實(shí)驗(yàn)后立即檢測(cè)或儲(chǔ)存于-20℃。

3. 反應(yīng)體系構(gòu)建

反應(yīng)管標(biāo)記：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，標(biāo)記N+9或N+4個(gè)PCR管，其中N為樣品數(shù)量，+9或+4分別用于標(biāo)準(zhǔn)曲線、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

加入試劑：

每孔加入25μL反應(yīng)體系，包括模板DNA、引物、探針、dNTPs、Taq酶等。

陽性對(duì)照和陰性對(duì)照分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或無DNA的溶液。

4. PCR擴(kuò)增

初始變性：95℃預(yù)變性3分鐘。

循環(huán)擴(kuò)增：

溫度設(shè)置：95℃（變性）15秒，60℃（退火）30秒，72℃（延伸）1分鐘。

循環(huán)次數(shù)：通常為40次，每次循環(huán)后收集熒光信號(hào)。

熒光信號(hào)檢測(cè)：在60℃退火階段收集FAM通道的熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增過程。

5. 數(shù)據(jù)分析

定量分析：

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，Ct值為縱軸，計(jì)算待測(cè)樣品的DNA濃度。

根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值推算其濃度。

定性分析：

陰性對(duì)照無Ct值或Ct值≥40，陽性對(duì)照有典型擴(kuò)增曲線且Ct值<40，待測(cè)樣品根據(jù)Ct值判斷陽性或陰性。

6. 結(jié)果驗(yàn)證

必要時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：如凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)環(huán)境：實(shí)驗(yàn)應(yīng)在超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，避免污染。

個(gè)人防護(hù)：佩戴一次性手套、口罩和無塵工作服，避免直接接觸試劑。

試劑保存：所有試劑需避光保存，避免反復(fù)凍融。

廢棄物處理：實(shí)驗(yàn)后廢棄物需無害化處理

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